En 1504, volveu traballar en Milán,
que, naquela época, se atopaba baixo o control de Maximiliano Sforza
grazas ao apoio dous mercenarios suízos. Moitos dos alumnos que lle
interesaba a pintura coñeceron ou traballaron con Leonardo en Milán;
entre eles, cabo destacar a Bernardino Luini, Giovanni Antonio
Boltraffio e Marco d'Oggiono.O seu pai morreu ou 9 de xullo e
Leonardo foi apartado dá herdanza debido á súa ilexitimidade; así
e todo, máis tarde ou seu tío nomearíao ou seu herdeiro universal
O mesmo ano, Leonardo realizou estudos anatómicos e intentou
clasificar as súas innumerables notas. Tamén nesta época empezou a
traballar n'A Gioconda (1503-1506, e despois 1510-1515) obra
habitualmente considerada como un retrato de Lisa Gherardini ou, polo
nome de casada, Monna Lisa do Giocondo. Con todo, hai numerosas
interpretacións sobre este cadro que aínda son motivo de debate e
discusión.
En 1505, dedicouse a estudar o voo dos
paxaros e redactou ou Codice sul volo degli uccelli (Códice sobre ou
voo dos paxaros).A partir de entón, observacións, experiencias e
reconstrucións sucedéronse con moita intensidade.Un ano máis
tarde, ou goberno de Florencia permitiulle reunirse co gobernador
francés de Milán, Charles II d'Amboise, que ou retivo co a pesar
dás protestas por parte de Florencia. Leonardo quedou non medio de
disputas entre franceses e toscanos, e foi urxido polo tribunal para
que acabase A Virxe dás rochas co seu alumno Ambrogio de Predis,
mentres se atopaba traballando n'A batalla de Anghiari.
En 1507, Leonardo quedou como único
herdeiro do seu tío Francesco, pero os irmáns de Leonardo iniciaron
un procedemento para modificar ou testamento.Leonardo apelou a
Charles d'Amboise e a Florimond Robertet para que interviñesen non
seu favor.
Luís XII tornou a Milán e Leonardo
converteuse de novo non organizador dás festas que se celebraban na
capital lombarda.